1、第第 41 讲讲 无菌操作技术实践无菌操作技术实践 1.(2019 山东泰安模拟)洗衣机内部的环境非常潮湿,洗衣机使用时间越长,内 部滋生微生物的机会就越大。 研究人员利用洗衣机内桶背面的残留物进行了相关 实验。请回答: (1) 要制备固体培养基培养残留物中的微生物, 培养基中一般应含有 。 在倒平板操作后,将平板倒置,这样做的目的是_。 (2)以下各项中,需要消毒的是 ,需要灭菌的是 。 培养基与培养皿;玻棒、试管,烧瓶和吸管;实验操作者的双手。 (3)为了检测残留物中含有微生物的情况,要将残留物制成水样稀释,然后将 稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养,这种方法称 为 。
2、用该方法统计菌落数时是否需要对照组? 。为什 么?_。 答案 (1)水,碳源,氮源和无机盐 防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养皿 造成污染,还可使培养皿表面的水分更好的挥发 (2) (3)稀释涂 布平板法 需要 因为需要判断培养基是否被杂菌污染 2.(2019 四川雅安诊断)微生物的应用范围相当广泛,但优良菌种的选育是基础 和关键,是显著改善和提高产品种类、产量以及品质的先决条件。下图是菌株分 离和筛选的一般流程,据此回答问题。 采样 富集 分离 筛选 (1)采样:土壤有“微生物的天然培养基”之称,在寻找目的菌株时要根 据 。 (2)富集:人为控制条件使目的菌种占优势,同时 其他微生物生长, 例
3、如培养霉菌时需将培养基的 pH 调至 。 (3) 分离: 从物理性质上看, 分离需要配制 培养基, 并采用 法 灭菌,分离过程可采用 接种。 (4)筛选:根据菌落_特征进行鉴定(至 少答两点) 。 解析 (1)不同的微生物对生存环境的要求不同,因此在寻找目的菌株时,要 到相应的环境中寻找。 (2)在微生物富集步骤,要人为控制条件抑制其他微生物生长,并使得目的菌 种占优势,如培养霉菌时需将培养基的 pH 调至酸性,不仅有利于霉菌的生长, 还可以抑制其他杂菌的生长。 (3)分离菌种应该采用固体培养基,常用的接种方法有平板划线法或稀释涂布 平板法;接种菌种前需要利用高压蒸汽灭菌法对固体培养基进行灭菌
4、处理。 (4)不同的菌落具有不同的特征,可以根据菌落的形状、大小、隆起程度、颜 色、透明度等特征进行鉴定。 答案 (1)微生物对生存环境的要求,到相应的环境中寻找 (2)抑制或阻止 酸性 (3)固体 高压蒸汽灭菌 平板划线法或稀释涂布平板法 (4)形状、 大小、隆起程度、颜色、透明度 3.嗜盐菌常分布在晒盐场、盐湖、腌制品中,某生物兴趣小组对嗜盐菌进行了如 下探究和分析,请回答以下问题: (1) 获得嗜盐菌的第一步是从合适的环境中采集菌样, 然后按一定的方法分离、 纯化。培养嗜盐菌的培养基较普通培养基中 含量高。 (2)如图是采用不同接种方法接种嗜盐菌后纯化培养的效果图,其中图 方法不适合用于
5、微生物的计数,出现图 A 结果的原因是在操作时 。在 进行计数时,最终选取菌落数在 范围内的平板进行计数,不能选用菌落 数过多的平板的原因是_。 (3)在实验过程中,无菌操作是非常重要的,对实验过程中使用的玻璃器皿通 常使用 法进行灭菌。 解析 (1)由题意可知,嗜盐菌可以生长在高盐的环境中,故与普通培养基相 比,培养嗜盐菌的培养基中盐含量较高。 (2)获得图 A 所示效果的接种方法为 稀释涂布平板法,获得图 B 所示效果的接种方法为平板划线法,在微生物计数 时应该选用稀释涂布平板法接种。图 A 中菌落集中在平板的某区域,说明在操 作过程中涂布不均匀。在计数时,为了保证结果准确,一般选择菌落数
6、在 30 300 的平板进行计数, 若菌落数过多, 菌落重叠的概率大, 将产生较大误差。 (3) 对玻璃器皿的灭菌通常使用干热灭菌法。 答案 (1)盐(NaCl) (2)B 涂布不均匀 30300 菌落数过多,菌落 重叠的概率大,将产生较大误差(合理即可) (3)干热灭菌 4.(2019 山西太原模拟)反刍动物如牛和山羊,具有特殊的器官瘤胃,瘤胃中 生活着多种微生物,研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株,并对其降解纤维 素能力进行了研究,请回答: (1)在样品稀释和涂布平板步骤中,下列选项不需要的是 (多选) 。 A.酒精灯 B.培养皿 C.显微镜 D.无菌水 E.接种环 (2)向试管内分装含
7、琼脂的培养基时,若试管口粘附有培养基,需要用酒精棉 球擦净的原因是_。 (3)刚果红可与 形成红色复合物,研究人员在刚果红培养基平板上, 筛选到了几株有透明降解圈的菌落(见图 1) 。图中降解圈大小与纤维素酶的 有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是 (填图中序号) 。 (4)纤维素酶高产菌株在20 长期保存时,菌液中常需加入一定量的 保藏。 (5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株 A 和 B,在不同温度和 pH 条件下 进行发酵,测得发酵液中酶活性的结果见图 2,推测菌株 更适合用于人 工瘤胃发酵,理由是_。 答案 (1) CE (2) 避免培养基污染棉塞 (3) 纤维素 量与活性 菌 2
8、(4) 甘油 (5)B 发酵过程会产热和产酸,B 菌株在较高温度和酸性环境下酶的活 性更高 5. (2019 石家庄重点高中摸底) 牛奶富含矿物质和满足人体生长发育所需的多种 氨基酸,消化率高达 98%。长期饮用牛奶有利于增强体质,但牛奶也是多种病菌 的传播载体。如图是牛奶消毒及细菌检测实验的过程。请回答下列相关问题: ( 1 ) 培 养 基 中 的 蛋 白 胨 为 细 菌 的 生 长 提 供 的 营 养 物 质 主 要 有 (填两个) ,对培养基常采用 法进行灭菌。 (2) 步骤称为 消毒法, 步骤是_。 (3)步骤的接种方法是_。 微生物培养过程中,为防止冷凝水影响细菌的生长,需将培养皿
9、培养。 (4)将接种后的培养基放入 中培养,36 h 后取出,统计 3 个平板上的 菌落数分别是87、 83和85。 经过消毒后的牛奶中, 细菌数大约是 个/mL。 解析 (1)培养基中的蛋白胨为细菌的生长提供的营养物质主要有碳源、氮源 和维生素;常采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。 (2)图中步骤把牛奶放 在 80 恒温水浴锅中煮 15 min, 采用的是巴氏消毒法, 步骤是梯度稀释。(3) 接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法, 其中只有稀释涂布平板法可以用 于微生物计数。微生物培养过程中,为防止冷凝水影响细菌的生长,需将培养皿 倒置培养。 (4)将接种后的培养基放入恒温培养箱中,培
10、养 36 h 后,统计 3 个 平板上的菌落数分别是 87、83 和 85,由图可知稀释倍数为 103,因此,经过消 毒后的牛奶中,细菌数大约是(878385)/31038.5104(个/mL) 。 答案 (1)碳源、氮源(和维生素) 高压蒸汽灭菌 (2)巴氏 梯度稀释 (3)稀释涂布平板法 倒置 (4)恒温培养箱 8.5104 6.(2019 四川广安眉山一诊)经人工诱变获得的天冬氨酸缺陷型菌株,菌体自身 不能合成天冬氨酸,必须从外界环境中获取天冬氨酸才能生长繁殖。下图是科研 人员利用“影印法”筛选天冬氨酸缺陷型菌株的部分过程(注:基本培养基中不 含氨基酸,完全培养基中含所有种类的氨基酸)
11、。回答下列问题: (1) 过程接种的方法是 。 待测培养皿中的培养基是 (答“基 本”或“完全”)培养基。 (2)过程是将印在同一块丝绒布上的菌落,先后转印至两个不同的平板上。 该过程应该先转印到 (答“基本”或“完全”)培养基上,原因是 _。 (3) 完成过程的转印并在 28 的培养箱中培养 2 天后,两个平板上出现的菌 落有的相同,有的不同。完全培养基上出现的菌落 A 和菌落 B 中,不可能是天 冬 氨 酸 缺 陷 型 菌 株 的 是 菌 落 ( 答 “A” 或 “B ” ) , 原 因 是 _。 (4)为了进一步鉴定筛选到的菌株确实是天冬氨酸缺陷型菌株,科研人员又制 备了甲、乙两个平板,
12、这两个平板中营养成分的差异是 。将待鉴定菌种 接种到两个平板中,置于适宜条件下培养一段时间后,若观察到两个平板中菌落 的生长情况是 ,则说明该菌株是天冬氨酸缺陷型菌株。 解析 (1)分析图解可知,过程导致菌落均匀分布,因此该方法为稀释涂布 平板法;两种培养基分别培养是为了筛选出氨基酸缺陷型菌株,因此与基本培养 基相比,待测培养皿中特有的成分有氨基酸,类似于完全培养基。 (2)过程应 将印在丝绒布上的菌落先转印至基本培养基上, 原因是防止基本培养基中混入氨 基酸。 (3)比较基本培养基和完全培养基中的菌落可知,B 菌落在基本培养基上 能生长繁殖,说明它能合成天冬氨酸,不可能是天冬氨酸缺陷型菌株。
13、 (4)为了 进一步鉴定筛选到的菌株确实是天冬氨酸缺陷型菌株, 对照实验的两个平板中营 养成分的差异是是否含有天冬氨酸, 接种后若两个平板中菌落的生长情况是含有 天冬氨酸的平板上生长有菌落,另一个平板上不能生长,则说明该菌株是天冬氨 酸缺陷型菌株。 答案 (1)稀释涂布平板法 完全 (2)基本 防止基本培养基中混入氨基酸 (3)B B 菌落在基本培养基上能生长繁殖,说明它能合成天冬氨酸 (4)是 否含有天冬氨酸 含有天冬氨酸的平板上生长有菌落,另一个平板上不能生长 7.(2019 河南中原名校联考)回答与生物技术实践有关的问题: (1) 为了获得耐高糖、 耐酸特性的酵母菌菌种, 可以对野生菌种
14、进行 。 然后在 (培养基的物理状态)培养基上进行培养。 (2)通过选择培养,人们可以分离得到目的微生物耐高糖、耐酸特性的酵 母菌,选择培养的原则是_。 (3)在用平板划线法接种时,每次划线前都需要对接种环进行灼烧,其目的是 _。 (4)大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌,其代谢产物能与染料伊红美蓝 反应,使菌落呈黑色。为检测严重污染水体中的大肠杆菌数量,将水样适当稀释 后,取样涂布在上述平板培养基中,应选择颜色为 的菌落进行计数。该 方 法 是 通 过 统 计 平 板 上 的 菌 落 数 来 推 测 样 品 中 的 活 菌 数 , 其 原 理 是 。在接种大肠杆菌前,需先将灭菌后的空白培养
15、基 放 在 恒 温 箱 中 培 养 一 段 时 间 , 观 察 是 否 有 菌 落 生 成 , 其 目 的 是 _。 答案 (1)诱变处理(或紫外线照射或射线照射) 固体 (2)人为提供有利于目的菌生长条件,同时抑制或阻止其他微生物的生长 (3)杀死残留菌种,保证每次划线菌种来自上次划线末端 (4)黑色 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品 稀释液中的一个活菌 检测培养基制备是否合格(灭菌是否彻底) 8.为了分离和纯化高效分解石油的细菌,科研人员利用被石油污染过的土壤进行 如图 A 所示的实验。 (1) 步骤与步骤中培养基成分相比, 最大的区别是步骤培养基中 。 从功能上
16、讲,步骤中使用的培养基属于 培养基。 (2) 同学甲进行步骤的操作, 其中一个平板经培养后的菌落分布如图 B 所示。 该同学的接种方法是 出现图 B 结果可能的失误操作 是_。 (3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤的操作:将 1 mL 样品稀释 100 倍,在 3 个平板上分别接入 0.1 mL 稀释液;经适当培养后,3 个平板上的菌 落数分别为 56、58 和 57。据此可得出每升样品中的活菌数为 个。 (4) 步骤需要振荡培养, 原因是_。 (5)步骤后取样测定石油含量的目的是_。 解析 (1)步骤与步骤中培养基成分相比,最大的区别是步骤中使用的 培养基内石油是唯一碳源。步骤使用的
17、培养基中只有石油一种碳源,不能降解 石油的细菌在此培养基上不能生存,这类培养基属于选择培养基。 (2)根据图 B 平板经培养后的菌落分布可知,该同学的接种方法是稀释涂布平板法。平板上菌 落聚集分布,出现这种结果可能的失误操作是涂布不均匀。 (3)每升样品中的活 菌数(565758)/3101001 0005.7107(个) 。 (4)振荡可使菌体 与培养液充分接触,并且提高培养液中(溶解)氧的含量,提高营养物质的利用 率。 (5)为了筛选出分解石油能力最强的细菌,步骤后取样测定石油含量,选 取石油含量最低的培养基中的菌种。 答案 (1)石油是唯一碳源 选择 (2)稀释涂布平板法 涂布不均匀 (3) 5.7107 (4)提高培养液中(溶解)氧的含量,通过振荡可使菌体与培养液充 分接触,提高营养物质的利用率 (5)筛选出分解石油能力最强的细菌