1、 1 高中生物选修一生物技术实践高中生物选修一生物技术实践 知识点总结知识点总结 专题一 传统发酵技术的应用 课题一 果酒和果醋的制作 1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。 2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵 3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖 4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸有氧呼吸，大量繁殖。 C C6 6H H1212O O6 66O6O2 26CO6CO2 26H6H2 2O O 5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵酒精发酵。 C C6 6H H
2、1212O O6 62C2C2 2H H5 5OHOH2CO2CO2 2 6、2020左右左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在控制在 1818- -2525 7、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌野生型酵母菌。在发酵过程中,随着 酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色。在缺氧呈酸性的发酵液中，酵在缺氧呈酸性的发酵液中，酵 母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。 8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是异养需氧型异养需
3、氧型,生殖方式为二分裂 9、当氧气、糖源都充足时充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸醋酸；当缺少糖源缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，将乙醇变为乙醛， 再将乙醛变为醋酸。再将乙醛变为醋酸。 2C2C2 2H H5 5OHOH4O4O2 2CHCH3 3COOHCOOH6H6H2 2O O 10、控制发酵条件的作用醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入 氧气，也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌最适生长温度为 30303535，控制好发酵温度，使发酵时间缩短， 又减少杂菌污染的机会。有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。 11、实验流程：挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵
4、果酒（醋酸发酵果醋）挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵果酒（醋酸发酵果醋） 12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反 应呈现灰绿色灰绿色。先在试管中加入发酵液 2L，再滴入物质的量浓度为 3mol/L 的 H2SO43 滴，振荡混匀， 最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液 3 滴，振荡试管，观察颜色 13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口排气口是在酒精发酵时用来排出排出 二氧化碳二氧化碳的；出料口出料口是用来取样的取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管长而弯曲的胶管与瓶身相连接， 其目的是防止空气中微生物的污染防止空气中微生
5、物的污染。开口向下开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出有利于二氧化碳的排出。使用该使用该 装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。 酶 酶 酶 2 疑难解答 （1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。 （2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？ 如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需 拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。 （3）制葡萄酒时，为什么要
6、将温度控制在 1825？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在 30 35？ 温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度 范围内。而醋酸菌是适温菌，最适生长温度为 3035，因此要将温度控制在 3035。 课题二 腐乳的制作 1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉毛霉。毛霉是一 种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。 2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂
7、肪 水解为甘油和脂肪酸。水解为甘油和脂肪酸。 3、实验流程：让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制 4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。 前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。 后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。 5、将豆腐切成 3cm3cm1cm 的若干块。所用豆腐的含水量为含水量为 7070左右，水分过多则腐乳不易成形左右，水分过多则腐乳不易成形 样品水分含量（%）计算公式： ( (烘干前容器和样品质量烘干前容器和样品质量- -烘干后容器和样品质量烘干后容器和样品
8、质量)/)/烘干前样品质量烘干前样品质量 毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在 15151818，并保持一定的温度。 来源：1.来自空气中的毛霉孢子 2. 直接接种优良毛霉菌种 时间：5 天 加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，随着层数的加高而增加盐量， 接近瓶口表面的盐要铺厚一些。接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为 8 天左右。 3 用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质； 盐的浓度过高会影响腐乳的
9、口味盐的浓度过高会影响腐乳的口味 食盐的作用：食盐的作用：1.1.抑制微生物的生长，避免腐败变质抑制微生物的生长，避免腐败变质 2.2.析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易 酥烂酥烂 3.3.调味作用，给腐乳以必要的咸味调味作用，给腐乳以必要的咸味 4.4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。 配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量 一般控制在 12%左右。 酒的作用：酒的作用：1.1.防止杂菌污染以防腐防止杂菌污染以防腐 2.2.与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味与有机酸结合形成酯，
10、赋予腐乳风味 3.3.酒精含量的高低与腐乳后酒精含量的高低与腐乳后 期发酵时间的长短有很大关系期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含 量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。 香辛料的作用：1.调味作用 2.杀菌防腐作用 3.参与并促进发酵过程 防止杂菌污染：用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。装瓶时，操作要迅速小心。整防止杂菌污染：用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗
11、刷干净后要用沸水消毒。装瓶时，操作要迅速小心。整 齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口 被污染。被污染。 疑难解答 （1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？ 豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。 （2）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？ 含水量为 70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。 （3）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它
12、对人 体有害吗？它的作用是什么？ “皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”， 使腐乳成形。 课题三 制作泡菜 制作泡菜所用微生物是乳酸菌乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型异养厌氧型。在无氧条件下，降糖分解为乳酸在无氧条件下，降糖分解为乳酸。分裂方 式是二分裂。反应式为：C C6 6H H1212O O6 6 酶 2C2C3 3H H6 6O O3 3+ +能量能量 常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。 亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。 4 膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康膳食中的亚硝酸盐一般不会危
13、害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg， 婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜 pH 、温度和一定微生物作用下 形成致癌物质亚硝胺。 一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在 10 天之后食用最好 *测定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应重氮化反应后，与 N-1-萘 基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。 专题二 微生物的培养与应用 课题一 微生物的实验室培养 培养基按照物理性质物理性质可分为液体培养基液体培
14、养基、半固体培养基半固体培养基和固体培养基固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂琼脂 （是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培 养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基液体培养基应用于工业 或生活生产，固体培养基固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保 藏等。 按照成分成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。人工合成培养基和天然培养基。合成培养基合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成， 其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养
15、基天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成， 常用于实际工业生产。 按照培养基的用途用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基选择培养基和鉴定培养基。选择培养基选择培养基是指在培养基中加入某种化 学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基鉴别培养基是根据微生物的特点，在 培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。 培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。 碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如 CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机 碳源。异养微生物只能利用有
16、机碳源。单质碳不能作为碳源单质碳不能作为碳源。 氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如 N2、NH3、NO3 -、NH 4 +（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、 牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用只有固氮微生物才能利用 N N2 2。 培养基还要满足微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌乳酸杆菌时需要在培养基 中添加维生素维生素，培养霉菌霉菌时须将培养基的 pH 调至酸性酸性，培养细菌细菌是需要将 pH 调至中性或微碱性中性或微碱性，培养厌厌 氧型微生物氧型微生物是则需要提供无氧无氧的条件 无菌技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注
17、意以下几个方面： 对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 5 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近进行。 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 消毒与灭菌的区别 消毒消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽 孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法煮沸消毒法，巴氏消毒法巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）
18、还有化学药剂化学药剂（如酒精、 氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒紫外线消毒。 灭菌灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、灼烧灭菌、 干热灭菌、高压蒸汽灭菌。干热灭菌、高压蒸汽灭菌。 灭菌方法： 接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； 玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ； 培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。 制作牛肉膏蛋白胨固体培养基 （1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 （2）倒平板操作
19、的步骤： 将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。 用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约 1020mL） 倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。 等待平板冷却凝固，大约需 510min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。 倒平板操作的讨论 1.培养基灭菌后，需要冷却到 50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 提示：可以用手触摸用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平 板了。 6 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口
20、通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使 培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生 物吗？为什么？ 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。 纯化大肠杆菌 （1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法和稀释涂布平板法。 （2）平板划线法是通过接种环在琼脂固
21、体培养基在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释逐步稀释分散到培 养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。 （3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培 养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作稀释操作和涂布平板操作涂布平板操作两步。 （4 4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在 培养基表面形成培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种
22、。单个的菌落，以便于纯化菌种。 （5）平板划线法操作步骤： 将接种环放在火焰上灼烧放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。 将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。 将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平 板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破不要划破培养皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划 线的末端末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线不要将最后一区的划线 与第一区相连与第一区相连。将平板倒置放入培养箱中培养。 平板划线操作的讨论 1
23、.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧 接种环吗？为什么？ 答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接 种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上 次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束 7 后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。能及时杀死接种环上残
24、留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数 目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌单个细菌繁殖而来的菌落。 （6）涂布平板操作的步骤： 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810s。用涂布器将菌液均匀地涂布在 培养基表面。 涂布平板操作的讨论 涂布平
25、板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第 2 步应如何进行无菌操作？ 提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任 何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。 菌种的保存 （1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏临时保藏的方法。 临时保藏方法 将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入 4 4的冰 箱中保藏。以后每 36 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。 缺点缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。保存的时间不长，菌种容易被污染或产
26、生变异。 （2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏甘油管藏的方法。 在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。将 1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后， 放在2020的冷冻箱中保存。 疑难解答 （1）生物的营养 人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。 8 植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。 微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。 （2）确定
27、培养基制作是否合格的方法 将未接种的培养基在恒温箱中保温 12 天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重 新制备。 课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之 后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶脲酶 尿素最初是从人的尿液中发现的尿素最初是从人的尿液中发现的 筛选菌株 （1）实验室中微生物的筛选应用的原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 （2）选择性培养基 在微生物学中，将允
28、许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作 选择培养基选择培养基。 （3）配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物有机物 可以选择培养自养微生物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可 选择培养金黄色葡萄球菌等。 统计菌落数目 （1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法稀释涂布平板法和显微镜直接计数显微镜直接计数。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的
29、一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计 平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置 3 35 5 个平板， 选择菌落数在 303030300 0 的平板进行计数，并取平均值取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统 计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在 30300 之间的平板进行计数 2.为了防止菌落蔓延，影响计 数，可在培养基中加入 TTCTTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物 9 （1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在
30、富含有机质的土壤表 层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH7 的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约 3 38cm8cm 的土壤层取样。 （2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀 释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在以保证获得菌落数在 3030030300 之间，适于计数的平板。之间，适于计数的平板。 测定土壤中细菌的数量，一般选用测定土壤中细菌的数量，一般选用 1010 4 4 1010 5 5 10 10 6 6 测定放线菌的数量，一般选用测定放线菌的数量，一般选用 1010 3 3 1010 4 4 10 10 5 5 测
31、定真菌的数量，一般选用 测定真菌的数量，一般选用 1010 2 2 1010 3 3 10 10 4 4 （3）微生物的培养与观察 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌细菌 30373037 1212 天天 放线菌放线菌 25282528 5757 天天 霉菌霉菌 25282528 3434 天天 每隔 2424 小时小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而 导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物 表现出稳定的菌落特征（形状、大小、隆起程度、颜色） 疑难解答 （1）如何从平板上
32、的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3 个平板，计算出平板菌落数的平均值 每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数= =（C/VC/V）*M *M 其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平 板时所用的稀释液的体积（ml），M 代表稀释倍数 课题三 分解纤维素的微生物的分离 纤维素纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质最丰富的多糖类物质。 纤维素与纤维素酶 （1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。 （2）纤维
33、素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 C C1 1酶、酶、C CX X酶和葡萄糖苷酶酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使 纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生 长提供营养。 10 纤维素分解菌的筛选 （1）筛选方法：刚果红染色法刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。 （2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理 刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖 和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形 成红色复合物。当纤维素被
34、纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤 维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 分离分解纤维素的微生物的实验流程 土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释将样品涂 布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落 （1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。 （2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板 （3）刚果红染色法种类 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就
35、加入刚果红。 课题延伸 对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌， 还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵液体发酵和固固体发酵体发酵两种。纤维素酶的测定方 法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。 疑难解答 （1）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？ 由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这 种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。 （2）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集
36、，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一 般应将纸埋于深约 10cm 左右腐殖土壤中。 （3）两种刚果红染色法的比较 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示 出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由 于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种 11 只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产 生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会 降
37、解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。 （4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种 营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。 专题三 植物的组织培养技术 课题一 菊花的组织培养 植物组织培养的基本过程 细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。 离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织愈伤组织，愈伤组织的细胞排列愈伤组织的细胞排列 疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞疏松而无规则，是
38、一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组 织的过程，称为植物细胞的脱分化脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新 分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物 体。 植物细胞工程 具有某种生物全套遗传信息全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体完整个体的能力，即每个生物细胞都具有全全 能性能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间特定的时间和空间条件下，通过基因的选选 择性表达择性表达，构成不同组织和器官。 植物组织培养技术的应用有：实现
39、优良品种的快速繁殖快速繁殖；培育脱毒作物脱毒作物；制作人工种子人工种子；培育作物新品种新品种 以及细胞产物的工厂化生产工厂化生产等。 细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？ 使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。 比较根尖分生组织和愈伤组织的异同 影响植物组织培养的条件 材料：材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物材料的选择直接关系到试验的成败。植物的种类、 组织类型 细胞来源 细胞形态 细胞结构 细胞排列 细胞去向 根尖 分生组织 受精卵 正方形 无液泡 紧密 分化成多种 细胞组织 愈伤组织 高度分化细胞 无定形 高度液泡化 疏松 再分化
40、成新个体 相同点 都通过有丝分裂进行细胞增殖 12 材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的未开花植物的茎上部新萌生的 侧枝作材料侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩 枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。 营养：营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培常用的培 养基是养基是 MSMS 培养基，其中含有的大量元素是培养基，其中含有的大量元素是 N N、P P、S S、K
41、 K、CaCa、MgMg，微量元素是，微量元素是 FeFe、MnMn、B B、ZnZn、CuCu、MoMo、I I、 CoCo，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。 激素：激素：植物激素中生长素生长素和细胞分裂素细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的 情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、 使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。 环境条件：环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将 pHpH 控制
42、在控制在 5.85.8 左右左右，温度控制在 18221822，并且每日用日光灯照射每日用日光灯照射 12h12h. 4、操作流程 配制配制 MSMS 固体培养基固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液浓缩液（培养基母液）。 使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。 配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏 水定容到 1000 毫升。 在菊花组织培养中，可以不添加植物激素原因是菊花茎段组织培养比较容易可以不添加植物激素原因是菊花茎段组织培养比较容易。 灭菌：采
43、取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌。 MS 培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS 培养基有哪些特点？ 大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等 物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。 微生物培养基以有机营养有机营养为主，MS 培养基则需提供大量无机营无机营养养。 使用顺序 实验结果 先生长素，后细胞分裂素 有利于分裂但不分化 先细胞分裂素，后生长素 细胞既分裂也分化 同时使用 分化频率提高 生长素 细胞分裂素比值与结果 比值高时 促根分化，抑芽形成 比值低时 促芽分化，抑根形成
44、 比值适中 促进愈伤组织生长 13 外植体的消毒外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。 菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗 20min 左右。用无菌吸水 纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为 70%的酒精中摇动 23 次，持续 67s，立即将外植体取出，在 无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为 0.1%的氯化汞溶液中 12min。取出后，在无菌水中至少清洗 3 次，漂洗消毒液。 注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。 接种：接种：接
45、种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种 78 个外植体。外植体接种与细菌接 种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。 培养：培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（1822）和光照（12h） 移栽：移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗 移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。 栽培栽培 外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染； 锥形瓶密封性差等。 专题二 月季的花药培养 被子植物的花粉发育被子植物的雄蕊通常包含花丝花丝
46、、花药花药两部分。花药为囊状结构囊状结构，内部含有许多花粉。 花粉是由花粉母细胞花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经 历小孢子四分体时期小孢子四分体时期、单核期单核期和双核期双核期等阶段。在小孢子四分体时期，4 个单倍体细胞连在一起，进入单 核期时，四分体的 4 个单倍体细胞彼此分离，形成 4 个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生 质，核位于细胞的中央（单核居中期单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期单核靠边期）， 并分裂成 1 个生殖细胞核和 1 个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生
47、殖细胞，一个是营养细胞。 生殖细胞将在分裂一次，形成两个精子。 注意：注意：成熟的花粉粒有两类，一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核，二核花 粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一次有丝分裂， 形成两个精子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核）花粉发育过程中的四分体和动物 细胞减数分裂的四分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分裂形成的 4 个连在一起的单 倍体细胞；而动物细胞减数分裂过程中的四分体是联会配对后的一对同源染色体，由于含有四条染色单体 而称为四分体。同一生殖细胞形成的两个精子，其基因组成完全相同
48、。 产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径两种途径，一种是花粉通过一种是花粉通过 胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种 途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类激素的种类及其浓度配比浓度配比。 注意：注意：无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根先诱导生芽，再诱导生根 胚状体胚状体：植物体细胞组织培养过程中，诱 14 导产生的形态与受精卵发育成的胚非常类似的结构，其发育也与受精卵发育成的胚类似，有胚芽、胚根、 胚轴等完整结构，就像一粒种子，又称为细胞胚。 影响花药培养的因素诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择材料的选择与培养基培养基 的组成的组成是主要的影响因素 亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期月季的初花期。 合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高
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