1、 一.果酒制作的原理 生物选修 1 复习 专题专题 1 传统发酵技术的应用传统发酵技术的应用 课题课题 1 果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作 1. 菌种：酵母菌（异养，兼性厌氧型真菌） 。 （1） 有氧条件下：进行有氧呼吸，并大量繁殖。 C6H12O6+6O2 酶 6CO2+6H2O （2） 无氧条件下，进行酒精发酵。 C6H12O6 酶 2C2H5OH+2CO2 2. 发酵条件： 繁殖：20左右 （1） 温度 酒精发酵：1825 （2） 氧气：早期通入无菌空气，使酵母菌大量繁殖；后期密封，进行酒精发酵，经常拧松瓶盖放气。 （3） pH：酸性。 温馨提示：温馨提示： 在葡萄酒的自然发酵过程中，
2、起主要作用的是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。在发酵过程中，随着酒精度数 的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈现深红色。 在缺氧酸性条件下，酵母菌能生长繁殖，但绝大多数微生物的生长繁殖受到抑制。 二. 果醋制作的原理 1. 菌种：醋酸菌（好氧细菌，对氧气特别敏感） （1） 氧气、糖原充足时，酵母菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。 （2） 缺少糖原时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 C2H5OH+O2 酶 CH3COOH+H2O 温馨提示：温馨提示： 开瓶后的果酒如果密封不严，醋酸菌就会将乙醇变为乙醛，再变为醋酸（乙酸） ，从而导致果酒出现酸味， 此时变酸的酒的表面出现的菌膜（白色）
3、即为醋酸菌在液面大量繁殖而形成的。 2. 发酵条件： （1）温度：3035。 （2）氧气：充足的氧气。 三. 发酵装置 1. 充气口：在醋酸发酵时，连接充气泵进行充气。 排气口：排出酒精发酵时产生的 CO2。 出料口：用来取样，监测发酵情况。 （排气口通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接的目的是：防止空气中微生物的污染。 ） 温馨提示：温馨提示： 制果酒时，充气口要关闭；制果醋时，充气口要连接气泵，输入氧气。（厌氧制酒，需氧制醋） 四. 实验流程 1. 挑选新鲜的葡萄 2. 冲洗：冲洗后再去枝梗，可以避免除去枝梗时引起葡萄破损，减少杂菌污染的机会。不宜反复冲洗。 3. 榨汁：榨汁机需清洗并晾干，防
4、止污染发酵液。 4. 酒精发酵： （1） 发酵瓶要清洗干净，用体积分数为 70%的酒精消毒，或用洗涤精洗涤。 （2） 装入葡萄汁后，封闭充气口。 温馨提示：温馨提示： 葡萄汁装入发酵瓶时，要留有大约 1/3 的空间：既利于酵母菌有氧呼吸大量繁殖，获得更多菌种，又可以防 止 CO2 引发的发酵液溢出。 如用带盖的瓶子这种简易装置时，每隔 12 小时左右将瓶盖拧松一次，排出CO2，再将瓶盖拧紧。 （3）控制发酵温度，1825 （4）监测：通过出料口对发酵的情况（菌体数量、酒精浓度等）进行监测。 酒精的检测：酒精与酸性（浓硫酸）条件下的重铬酸钾反应形成灰绿色。 5. 醋酸发酵： （1）打开充气口，适
5、时连接气泵，通入无菌空气。 （2）控制发酵温度，3035 （3）醋酸发酵：有氧条件下，醋酸菌大量繁殖，形成白色菌膜，并出现酸味。 课题课题 3 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量制作泡菜并检测亚硝酸盐含量 一. 泡菜的制作原理 1. 菌种：乳酸菌（异养，厌氧型细菌，种类多，分布广泛） 。 常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌，乳酸杆菌常用于生产酸奶。 温馨提示：温馨提示：乳酸菌对抗生素敏感，牛奶中如果有抗生素，则会杀死或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛 奶不能用于发酵成酸奶。 2. 发酵原理： 无氧条件下：C6H12O6 酶 2C 3H6O3（乳酸） 配制盐水 修整、洗涤、晾晒、 切分成条状或片状
6、称取 食盐 加 入 调 味 料 ， 装 坛 二. 亚硝酸盐检测原理 1. 亚硝酸盐：白色粉末，易溶于水，用作食品添加剂，膳食中的亚硝酸盐绝大部分随尿排出，一般不会危害人体 健康。只有在特定的条件下（适宜的 pH 温度和一定的微生物作用） ，才会转变为致癌物亚硝胺亚硝胺。 温馨提示：温馨提示： 在腌制过程中，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成硝酸盐，危害人体健康，所以日常生活中要多吃新鲜蔬菜， 不 宜多吃腌制蔬菜。 2. 测定亚硝酸盐含量的原理（比色法） ： （1） 在硝酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸结合形成玫瑰红玫瑰红 色色染料。亚硝酸盐的浓度越高，
7、颜色越深。 （2） 将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较（样品液与标准液进行比色样品液与标准液进行比色） ，可以大致估算 出泡菜中亚硝酸盐的含量。 三. 实验流程 温馨提示：温馨提示： 将清水与盐的质量比为 4：1 的比例配制盐水，将盐水煮沸冷却（有效杀灭杂菌和去除水中的溶解氧） 。 当新鲜蔬菜装置八成满时，注入盐水，并使盐水没过全部材料，盖好坛盖。向坛盖边沿的水槽中注满水，以 保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境 硝酸盐含量测定的操作步骤：配制溶液制备标准显色液制备样品处理液比色。 腌制过程中要控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细 菌
8、大量繁殖，硝酸盐含量增加。硝酸盐的含量先增加后减少，一般硝酸盐含量在腌制 10 天后，开始下 降至相对稳定。 在腌制的过程中，由于乳酸菌比杂菌耐酸，所以乳酸菌数量增多，杂菌数量减少。 泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖，导致泡菜坛内长一层白膜。 专题专题 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用 课题课题 1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养 发酵 成品 测定亚硝酸盐的含量 选择原料 泡菜盐水 一. 培养基 1. 概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 2. 种类： 划分标 准 培养基种类 特点 用途及实例 物理性 质 液体培养基
9、不加凝固剂 工业生产 半固体培养基 加凝固剂，如：琼脂 观察微生物的运动、分类鉴 定、保藏菌种 固体培养基 微生物分离、鉴定、活菌计 数、 化学成 分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 合成培养基 培养基成分明确（用化学成分已知的 化学物质配成） 分类、鉴定 用途 选择培养基 培养基中加入某种化学物质，以抑 制不需要的微生物的生长，促进所 需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物（如：培养酵 母茵或霉菌， 可在培养基中加入青霉素；培养金黄色 葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食 盐） 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基 中加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物，
10、如可用伊红美 蓝培养基鉴 别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌 （若有，茵落呈深紫色，并带有金属光 泽） 3. 营养构成： 无机盐 为微生物提供大量除 C、H、O 以外的各种 元素 细胞组成成分，生命调节物质，自 养菌的能源或其他营养来源，酶的 激活剂 培养基、大气等环境 生长因 子 微生物正常生长繁 殖，必不 可少的微量有机物 可作为酶与核酸等的组成成分 维生素、氨基酸、碱 基等 警示 自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同 （1） 自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源 来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。 （2）
11、含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如 NH3 既作为硝 化细菌的氮源也作为能源。 选择培养基的选择方法 （1） 在培养基中加入某种化学物质。 例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。 （2） 改变培养基中的营养成分。 例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为惟一碳源时，可以分离出消除石油污染的微生物。 （3） 改变微生物的培养条件。 例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。 二. 无菌技术 1. 目的：防止外来杂菌的入侵。 2. 常见的主要方面： （1） 实验操作空间（接种室、接种箱或超净工作台） 、
12、衣着和手清洁和消毒。 （2） 培养器皿、接种用具、培养基等灭菌。 （3） 避免周围环境中微生物的污染酒精灯火焰旁操作。 （4） 避免以灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 营养物 质 定 义 作 用 主要来源及所涉及的 微生物 碳源 凡是能提供微生物所 需碳元素的物质 构成生物细胞、生物体及细胞代谢 产物，有些能为异养生物提供能源 无机化合物：CO2、NaHCO3 等（自 养生物） 有机化合物：糖类、脂 质、石油等（异养生物） 氮源 凡是能提供微生物所 需氮元素的物质 合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产 物，也可为异养微生物提供能源 无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝 酸盐，自养生物有机化合物：
13、尿 素、牛肉膏、蛋白胨等， 异养生物 水分 生物体内含量最高的 组成成分，分为结合 水和自由水 良好的溶剂、细胞生活及生化反应 的介质、参与物质运输及参与生化 反应的反应物 培养基、大气、代谢 产物 项目 概念 常用方法 应用范围 消毒 使用较为温和的物理或化 学方法，仅杀死物体表面或 内部一部分对人体等有害 的微生物（不包括孢子和芽 孢） 巴氏消毒法：7075水中煮 30min 或在 80水中煮 15min 一些不耐高温的物体如牛奶 煮沸消毒法：在 100水浴中煮沸 56 min 一般物品 化学药剂消毒法：用乙醇、氯气、漂白粉、 KMnO4 等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖 可用来对环境、双
14、手和衣物等消毒 紫外线消毒法：30W 紫外灯照射 30min 接种室 项目 概念 常用方法 应用范围 3. 消毒与灭菌： 温馨提示：温馨提示： 用乙醇消毒只能使细菌蛋白质变性，但是使用紫外线消毒既可以使蛋白质变性，还能损伤其 DNA 的结构。 三. 纯化大肠杆菌的实验操作 1. 培养基的制备（制备牛肉膏蛋白胨固体培养基） （1） 计算：根据配方比例，计算出各种成分的用量。 （2） 称量：准确的称取各种成分。 （3） 溶化，将成分加入水后进行溶化，并定容到一定体积。 注意先调pH，再灭菌（为了防止调 pH 过程中引起的再污染） （4） 灭菌：培养基（高压蒸汽灭菌） 、培养皿（干热灭菌） 。 （5
15、） 倒平板： 待培养基冷却后，让锥形瓶的瓶口通过火焰后，在酒精灯旁将培养基倒入平板，平板冷凝后， 将平板倒置。 温馨提示：温馨提示： 平板倒置的原因：防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养基造成的污染。防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养基造成的污染。 倒平板时不要将培养基溅在皿盖和皿底之间，否则容易引起培养基污染。 配制固体培养基时需要加入凝固剂：琼脂。（还可以用明胶、无机硅胶等。） 2. 纯化大肠杆菌： （1） 平板划线法： 概念：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在 数次划线培养后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体菌落。 灭菌
16、使用强烈的理化因素杀死 物体内外所有的微生物，包 括芽孢和孢子 灼烧灭菌法：酒精灯火焰 接种工具如接种环、接种针等 干热灭菌法：在 160170加热 12h 玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具 高压蒸汽灭菌：压力为 100 kPa，温度为 12l 的条件下，维持 1530 min 培养基及容器的灭菌 蛋白胨可提供：氮源和维生素。 尿素CO(NH2)2可为分解尿素菌提供氮源。 纤维素可为分解纤维素菌提供碳源。 操作步骤： 温馨提示：温馨提示： 接种环灼烧的目的：接种前灼烧是为了杀死接种环上的微生物，避免杂菌的污染；每次划线之前的灼烧是为 了杀死上一次划线后残留的菌种，使得每一次划线的菌种来自上一
17、次划线的末端，以便聚集的微生物得到稀释； 划 线结束的灼烧是为了杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。 灼烧了的接种环要冷却后才能操作，以免温度太高，杀死菌种。 二次以及其后的划线操作时，总是从上一次画线的末端开始划线的目的是：使细菌的数目随着划线次数的增 加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 （2） 稀释涂布平板法： 概念： 将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基的表面进行培养。 稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的 菌落。 操作步骤： a. 系列稀释操作： 9mL 无菌水 9mL 无菌水 9
18、mL 无菌水 9mL 无菌水 9mL 无菌水 9mL 无菌水 b. 涂布平板操作： 温馨提示：温馨提示： 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。 平板划线法和稀释涂布平板法，都是为了使聚集的菌种分散成单个细胞，以便得到纯化的菌落。 四. 菌种的保藏 1. 对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。（固体斜面培养基，4冰箱保存） 2. 对于长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。（与甘油充分混合，-20冷冻箱保存） 课题课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分布与计数土壤中分解尿素的细菌的分布与计数 一. 筛选菌株 1. 自然界中目的菌株的筛选： （1） 原理：根据对生存环境的要求，到相应环境中去寻
19、找。 （2） 实例：PCR 中使用的耐高温的 DNA 聚合酶Taq 酶就是从热泉中的Taq 细菌中发现的。 2. 实验室中目的菌的筛选： （1） 原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 （包括营养、温度、pH 等） （选择培养） （2） 选择培养基： 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。分离分解尿素 的细菌的培养基就是选择培养基，培养基中氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物 才能分解尿素。 （3） 实例： 以尿素为唯一氮源的培养基可以分离出分解尿素的细菌；以缺乏氮源的培养基可以分离出固氮微 生物；以石油为唯一氮源的培养基可
20、以分离出分解石油的微生物等等。 二. 统计菌落数目 1. 稀释涂布平板法： （1 1） 原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌； 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 温馨提示：温馨提示： 为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30300 的平板进行计数。 （2） 计算公式： 每克样品中的菌株数=（C V ） M 记忆示例：41 0.1 10 5=4.1 10 7 株 【C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V 代表涂布平板时所用的稀释液的体
21、积（mL） ；M 代表稀释倍数。】 温馨提示：温馨提示： 统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因 此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 2. 显微镜直接计数法：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算 45 个中格的细菌数目，并计算 出每个小格所含细菌的平均数，再以此为依据，估算出总菌数。缺点是不能区分死菌与活 菌 。 （所以统计得出的数值会比实际值偏大） 三. 设置对照 1. 目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 2. 实例：为排除培养基被杂菌污染，需要用未接种的培养基作为空白对
22、照；如果未接种的培养基无菌落产生，说 明培养基没有被污染。 四. 分解尿素的细菌分离实验设计 1. 原理：土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们体内含有脲酶，能将尿素催化分解为氨；能在以尿素为唯一氮源 的培养基上生长的细菌就能分解尿素。 2. 实验步骤： （1） 土壤取样：土壤是天然培养基，含有微生物种类多，数量大。 （2） 样品的稀释：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目；用一定稀释范围的样品液进行培养，以保 证获得菌落数在 30300 之间适于计数的平板。 （3） 微生物的培养与观察：将稀释的样品采用稀释涂布平板法接种到以尿素为唯一氮源的培养基上，放在 37 恒温培养箱中培养 2448h
23、 后，观察菌落的特征并每隔 24h 统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录 作为结果。 温馨提示：温馨提示： 不同微生物的培养温度不同；细菌一般在 3037的温度下培养；放线菌一般在 2528的温度下培养；霉菌 一般在 2528的温度下培养。 菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。菌落特征是鉴定菌种的重要依据。 （4） 菌种的鉴定： 在以尿素为唯一氮源的培养基中，加入酚红指示剂，分解尿素的细菌合成脲酶将尿素分解成氨，氨会使培 养基的碱性增强，pH 升高，会使指示剂变红。 专题专题 3 植物的组织培养技术植物的组织培养技术 课题课题 1 菊花的组织培养菊花的组织培养 1. 理论
24、基础：植物细胞的全能性。 （1） 基本过程：外植体 脱分化愈伤组织再分 化试管苗（丛芽、根等器官） 。 注意:生长素和细胞分裂素 的使用使用顺序不同 结果不同。 先生长素，后细胞分裂素：有利于细胞分裂，但不分化。先细胞分裂素，后 生长素：细胞既分裂也分化。同时使用：分化频率提高。 用量比例不同发育方向不同。 高：利用根的分化，抑制芽的形成。低：利用芽的分化，抑制根的形成。 适中：促进愈伤组织的生长。) （2） 外植体：是指用于组织培养的离体组织、器官、细胞。 （3） 脱分化：又叫去分化，是由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程 （4） 愈伤组织：由一种排列疏松而无规则、无固定形态、高度液
25、泡化的薄壁细胞构成。 （5） 再分化：脱分化的愈伤组织继续培养，重新分化成根或芽等器官的过程。 二、影响植物组织培养的因素 1. 材料的选择： （1） 不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。 （2） 同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。 温馨提示：温馨提示： 菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。一般容易无性繁殖的植物也容易进行组织培养。 2. 营养成分：常用的培养基是 MS 培养基。 （1） 大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S。 （2） 微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co。 （3） 有机物： 甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等
26、。 温馨提示：温馨提示： 大量元素和微量元素提供给植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨 酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生 物培养基以有机物为主，而 MS 培养基需要提供大量无机营养。 3. 植物激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。植物激素的浓度、 使用顺序及用量比例都会影响实验结果。 4. 其他因素：温度、pH、光照等环境条件也很重要。 三. 实验操作 1. 制备 MS 固体培养基：配制各种母液配制培养基灭菌。 2. 外植体消毒：取生长旺盛的嫩枝流水冲洗
27、加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗流水冲洗 20min无菌吸水纸 吸干放入体积分数为 70%的酒精中摇动 23 次，持续 67s无菌水清洗无菌吸水纸吸千放 入质量分数为 0.1%的氯化汞溶液中 12min无菌水清洗至少 3 次，漂净消毒液。 3. 接种：必需在酒精灯旁进行，每次使用器械后，都要灼烧灭菌。菊花茎段插入培养基时注意方向，不能倒插， 4. 培养：无菌培养箱中培养，培养期间定时消毒；温度控制在 1822，每日光照 12h。 5. 移栽：移栽前，先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日，再用流水洗净根部的培养基，把幼苗移 植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间，等幼苗长壮后再移栽到
28、土壤中。 6.栽培：幼苗移栽后，适时浇水、施肥等管理，直至开花。 专题专题 5 DNA 和和 蛋白质技术蛋白质技术 课题课题 1 DNA 的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 一. 基础知识 1. DNA 的溶解性： DNADNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaClNaCl 溶液中溶解度不同。溶液中溶解度不同。DNADNA 在物质的量浓度为在物质的量浓度为 0.14mol/L0.14mol/L 的的 NaClNaCl 溶液中溶解度最小，利用这一特点，选择适当的溶液中溶解度最小，利用这一特点，选择适当的 NaClNaCl 溶液就能使溶液就能使 DNADNA 充分溶解，
29、而使杂质沉淀，以达到分离目充分溶解，而使杂质沉淀，以达到分离目 的。此外，的。此外，DNADNA 不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将 DNADNA 与蛋白质进一与蛋白质进一步步 地分离。地分离。 2. DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性： （1） 蛋白酶能水解蛋白质，但对 DNA 没有影响。 （2） 大多数蛋白质不能忍受 6080的高温，而 DNA 在 80以上才会变性。 （3） 洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对 DNA 没有影响。 3. DNA 的鉴定：在沸水浴条件下，DNA 与二苯胺呈蓝色。 二.
30、实验设计 1. 实验材料的选取：选用 DNA 含量相对较高的生物组织，如鸡血、菜花等。 温馨提示：温馨提示： 由于哺乳动物成熟的红细胞不含细胞核，因此不能选用哺乳动物的血作为实验材料。 以鸡血为实验材料时，要加入柠檬酸钠，目的是防止血液凝固。 2. 破碎细胞，获取 DNA 的滤液： （1） 动物细胞（以鸡血为例） ： 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒不断地搅拌，过滤后收集得到滤液。 加蒸馏水是利用渗透作用的原理，让红细胞吸水涨破，便于 DNA 的释放。 （2） 植物细胞（以洋葱为例） ： 在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。 洗涤剂是一些
31、离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于 DNA 的释放；食盐的主要成分是 NaCl，有利于 DNA 的溶解。 3. 去除滤液中杂质 （1） 方案一：DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，通过控制NaCl 溶液的浓度去除杂质。 （2） 方案二：蛋白酶分解蛋白质，不分解 DNA。 （3） 方案三：蛋白质和 DNA 的变性温度不同。 4. DNA 的析出与鉴定： （1） 析出： 将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精（体积分数为 95%）静置 23min， 溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的 DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并 用滤纸吸去上面的水分。 （2） 鉴定：
32、 取两支 20ml 的试管，各加人 2mol/L 的 NaCl 溶液 5mL，将丝状物放入其中一支试管中溶解；然 后，向两支试管中各加人 4mL 的二苯胺试剂混匀，置于沸水中加热 5min，冷却后，比较颜色变 化。试管出现蓝色，说明溶液中有 DNA；反之，则不含。 课题课题 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增 DNA 片段片段 一. PCR 原理 1. PCR（多聚酶链式反应） ： 一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术，它能以极少的 DNA 为模板，在几小时内复制 出上百万份的 DNA 拷贝。 2. 细胞内 DNA 复制需要的条件： （1） DNA 母链：提供 DN 复制的模板。DNA
33、是反向平行的双链，通常将 DNA 的羟基（OH）末端称为 3 端，而磷酸基团的末端称为 5端。 （2） 解旋酶：打开 DNA 双链。 （3）4 种脱氧核苷酸：合成子链的原料。 （4） DNA 聚合酶： 催化 3端延伸，将脱氧核苷酸聚合形成 DNA 子链。DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸。 （5） 引物： 一小段能与 DNA 母链互补配对的 DNA 或 RNA 片段，引导 DNA 聚合酶从引物的 3端开始连接脱 氧核苷酸。 3. PCR 条件的控制： （1） 解旋：不需要解旋酶，采用加热至 80100，使双链全部解开，该过程称为变性。 （2） DNA 聚合酶：采用耐高温的 Taq
34、DNA 聚合酶。 （3） 缓冲条件。 温馨提示：温馨提示： PCR 需要的条件：DNA 模板、两种引物、4 种脱氧核苷酸、耐高温的 DNA 聚合酶、缓冲溶液、控制温度。 二. PCR 的过程 1. 过程： （1） 高温变性： 当温度上升到 90以上时，双链 DNA 变性解旋为单链。 （2） 低温复性： 当温度下降到 50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合，该过程称 为复性（退火） 。 （3） 中温延伸： 当温度上升到 72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互 补配对原则合成新的 DNA 链。 2. 结果：DNA 聚合酶能特异地复制处于两个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 3. 结果分析： （1） 原理：DNA 在 260nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰。 （2） 计算公式：DNA 含量（g/mL）=50 （260nm 的读数） 稀释倍数。
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