1、第5课时 微生物的实验室培养(二),专题2 微生物的培养与应用,学习导航 1.通过阅读教材P1617“(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基”，掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。 2.结合教材P1819“(二)纯化大肠杆菌”，理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。 重难点击 1.掌握制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法。 2.学会用平板划线法和稀释涂布平板法纯化微生物。,一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,当堂检测,二、微生物的分离与纯化技术,内容索引,一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,基础梳理,牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化就是用的该培养基。
2、1.牛肉膏蛋白胨培养基的成分及各成分提供的营养,2.制备步骤 (1)培养基的配制 计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基 的比例，计算配制100 mL培养基时各成分的用量称量,琼脂,配方,称量纸,蛋白胨,迅速称取,溶化：1 moL的NaOH、pH试纸，将pH调为7.4 7.6,调节pH,琼脂,100,：趁热分装到洁净锥形瓶中 加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水 包扎：外包 纸，且挂标签,牛皮,分装,(2)灭菌(3)倒平板 将 的培养皿放在 的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 右手拿锥形瓶，使瓶口 。 用左手将培养皿打开一条 的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的
3、皿盖。 等待平板冷却凝固后，将平板 。,倒过来放置,高压蒸汽,干热,灭过菌,火焰旁,迅速通过火焰,稍大于瓶口,1.填表比较溶化时两次使用玻棒搅拌的目的,问题探究,防止琼脂糊底而导致烧杯破裂,促使蛋白胨和氯化钠溶解,答案 琼脂是一种多糖，在98 以上熔化，在44 以下凝固，倒平板时高于50 则会烫手，低于50 时若不及时操作，琼脂会凝固。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.倒平板时的注意事项 (1)培养基灭菌后，需要冷却至50 左右时，才能倒平板的原因是什么？你用什么办法来估计培养基的温度？,答案,答案 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染
4、培养基。,(2)分析右图，回答、问题： 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。,从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？,答案,答案 未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。,(3)怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？,答案,拓展应用,1.某学校开展大肠杆菌培养活动，首先对实验室进行清扫和消毒处理，然后准备各种原料和用具。请回答下列问题： (1)对买回
5、来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料： 。 (2)微生物在生长过程中对各种成分需求量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停 ，防止 。 (3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌。灭菌完毕后拔掉电源，待压力表的压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。,牛肉膏、蛋白胨、蒸馏水、NaCl、琼脂,比例,搅拌,琼脂糊底引起烧杯破裂,高压蒸汽灭菌锅,废弃,答案,2.制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，关于倒平板的具体描述正确的是 待培养基冷却至40 左右时，在酒精
6、灯火焰附近倒平板 将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞 右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰 用左手的拇指和食指完全打开皿盖 右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 等待平板冷却510 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上 A. B. C. D.,答案,解析,问题导析,问题导析 (1)培养基灭菌后，需冷却至 左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 以下凝固。 (2)倒平板的过程要在 附近进行。,答案,返回上页,酒精灯火焰,50 ,返回上页,解析 琼脂是一种多糖，在98 以上可溶解于水，在44 以下凝固，倒平板时高于50 则会烫手，低于50 时若不能及时操作，琼脂会凝固。无菌
7、操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(大约需510 min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。,答案 要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，酒精灯火焰旁属于灼烧灭菌。,一题多变 倒平板的过程需要进行无菌操作，在培养基的制备过程中，还有哪些环节需要进行无菌操作？,答案,二、微生物的分离与纯化技术,基础梳理,1.纯化大肠杆菌 (1)平板划线法 原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步 到培养基的表面。 步骤 接种环灭菌：将接种环放在酒精灯火焰上灼烧直至烧红,连续划线,稀释分散,取菌种,火焰旁,棉塞,火焰,冷却
8、,通过火焰,平板 划线 培养：将平板 ，放入培养箱中培养,三至五,不要划破培养基,划线的末端,第一区,倒置,(2)稀释涂布平板法 原理：将菌液进行一系列的 ，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,梯度稀释,步骤 .系列稀释操作 a.编号为101106试管中分 别盛有 水。 b.用移液管吸取 培养 的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。 c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。 注意 移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。,9 mL,1 mL,.涂布平板操作 涂布器消毒：将涂布器浸在盛有
9、的烧杯中 取菌液：取少量菌液滴加到 表面 涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后， 810 s 涂布平板：用涂布器将 均匀涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀,酒精,培养基,冷却,菌液,2.菌种保藏,频繁使用,长期保存,固体斜面,液体,4 ,灭菌,1.平板划线操作注意事项 (1)平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？,问题探究,答案 接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。 划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。 接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。 划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。,答案,(2)在灼
10、烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答案 避免接种环温度太高，杀死菌种。,答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,(3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？,答案 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,(4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答案,答案 划线后末端含有的细菌数目
11、较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。,(5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答案 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。,(6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？,答案,答案 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体，吸管要在酒精灯火焰附近等。,2.稀释涂布平板操作注意事项 (1)涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想将菌液滴加到培养基
12、上时应如何进行无菌操作？,答案 培养未接种培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染，需要重新制备。,(2)操作结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？,答案,归纳总结,两种接种方法比较,拓展应用,3.稀释涂布平板法是微生物培养中常用的一种接种方法。下列相关叙述错误的是 A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释 B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形
13、成单个菌落 D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理,答案,解析,解析 稀释涂布平板法要先将菌液进行一系列的梯度稀释，A项正确； 只有在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落，故而要将不同稀释度的菌液分别涂布平板，B项正确、C项错误； 在稀释涂布过程中，为防止杂菌污染，要对培养基和涂布器等进行严格灭菌处理，D项正确。,答案 为保证结果准确，每个稀释度的菌液一般涂布3个平板，并对结果取平均值。,一题多变 (1)B项中不同稀释度的菌液一般涂布几个平板为宜？,答案 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入适宜温度的恒温箱中，培养12
14、h和24 h后，观察培养基上的菌落情况，若未接种的培养基上无菌落生长，则证明操作是成功的；否则不成功。,(2)如何证明该接种过程是成功的？,答案,答案 可能是稀释度不够，聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。,(3)题中如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落，原因可能是什么？,答案 菌落种类和数目增多。,(4)如果不进行D项操作，培养基上的菌落可能有哪些变化？,答案,4.图甲是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙是平板划线法操作结果。 下列叙述中，错误的是 A.甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液 B.对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或
15、孢子繁殖而成 C.乙中培养皿中所得的菌落都符合要求 D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端,答案,解析,问题导析,问题导析 (1)对菌液进行稀释时，菌液中菌体的浓度越高，则稀释的倍数也要 ，菌体的浓度低时，则稀释的倍数不必 。 (2)高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要 后才能接触菌种。 (3)平板划线法的多次划线中，菌体 ，即不同划线处的_ 不同，所以形成的菌落并非全部是由单个菌体繁殖而成的。,越高,太高,冷却,越来越少,菌体数目,答案,返回上页,返回上页,解析 灼烧后的接种环如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确； 稀释倍数过低，会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落
16、，B正确； 平板划线法中一般最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误； 连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。,答案 决定稀释倍数及划线次数的因素是菌液的浓度，如果菌液的浓度较高则需要高倍数的稀释，所划线次数也要较多，否则就可以低倍稀释或减少划线次数。,一题多变 稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键，决定稀释倍数和划线次数的因素是什么？,答案,两种接种方法中，只有稀释涂布平板法才适合对细菌进行计数的原因 只要稀释倍数足够高，则稀释涂布平
17、板法中形成的每个菌落都是由单一菌体繁殖而成的，即一个肉眼看不见的细菌对应着一个可以看见的菌落，可以通过统计菌落的数目推测出细菌的数目。而平板划线法中除了最后一次划线末端处的菌落是由单一的细菌繁殖而成的，其他每个菌落往往是由多个细菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个细菌，所以不适合用于细菌的计数。,课堂小结,称量,倒平板,平板划线法,稀释涂布平板法,当堂检测,2,3,4,5,1,1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是 A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板,答案,解析,解析 制备牛肉膏蛋白
18、胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。,2,3,4,1,5,2.平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是 A.接种时再拿起来方便 B.在皿底上标记日期等方便 C.正着放置容易破碎 D.防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染,答案,解析,解析 平板倒置主要是防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。,3.如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是 A.操作前不用进行任何处理 B.划线操作必须在火焰上进行 C.在5区域中才可以得到所需菌落 D.在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌,解析 划线之前应对接种环灭菌；划线操作在酒精灯火焰旁进
19、行；从1区域至5区域菌落密度越来越小，可能会在3、4、5区域得到所需菌落。,2,3,4,1,5,答案,解析,4.分离纯化大肠杆菌最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述错误的是 A.均将大肠杆菌接种在固体培养基的表面 B.获得的每个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群 C.都应在火焰附近进行操作，以防止杂菌污染 D.稀释分散菌种的原理不同，均能达到分离纯化大肠杆菌的目的,解析 用稀释涂布平板法时，如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌细胞繁殖形成的。平板划线中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，
20、这种菌落才符合要求。,2,3,4,1,5,答案,解析,5.下表是从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答下面的问题。,解析 培养微生物的培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。牛肉膏、蛋白胨既是碳源又是氮源；培养基在接种前必须灭菌处理。,(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、 和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是 。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行 处理。,氮源,牛肉膏和蛋白胨,灭菌,2,3,4,1,5,答案,解析,(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是 和 。,平板划线法,稀释涂布平板法,2,3,4,1,5,答案,解析,解析 微生物的接种方法包括平板划线法和稀释涂布平板法两种。,(3)假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举两项)_。,稀释倍数不够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌又接着划第二次；培养过程灭菌不严格，受到微生物的污染,解析 多种因素都会导致接种的菌种密度较大，没有形成单一的菌落。,
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