1、第14课时 多聚酶链式反应扩增DNA片段,专题5 DNA和蛋白质技术,学习导航 1.阅读教材P58“(一)”，分析PCR技术与DNA复制的区别和联系，掌握PCR技术原理。 2.阅读教材P59“(二)”，分析PCR的过程，掌握PCR循环的原理。 3.阅读教材P62“实验操作及操作提示”，掌握PCR技术的实验操作过程及注意事项。 4.阅读教材P6263“结果分析与评价”，掌握DNA含量测定的方法。 重难点击 1.了解PCR技术的基本操作。 2.理解PCR的原理。 3.讨论PCR的应用。,一、PCR原理与反应过程,当堂检测,二、PCR的实验操作,内容索引,一、PCR原理与反应过程,基础梳理,1.PC
2、R原理与条件 (1)PCR的概念 PCR即 ，是一种体外迅速扩增 的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。,多聚酶链式反应,DNA片段,(2)细胞内DNA复制的基本条件,解旋酶,模板,脱氧核苷酸,DNA聚合酶,3,(3)PCR原理 DNA变性：在 的温度范围内，DNA的 将解体，双链分开，这个过程称为变性。 DNA复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的 又会重新结合成双链，这个过程称为复性。 子链的合成：DNA聚合酶从引物的 开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的 向 延伸。,80100 ,双螺旋结构,DNA链,3端,5端,3端,(4)PCR条件 原料
3、： 。 模板：加热变性解旋后的两条DNA母链。 酶：耐热的 。 引物：使DNA聚合酶能够从引物的 开始连接脱氧核苷酸。 其他条件：需要稳定的缓冲溶液和能自动调节温度的温控设备等。,4种脱氧核苷酸,DNA聚合酶,3端,2.PCR过程与结果 (1)PCR过程,90,单链,50,两种引物,单链DNA,72,DNA聚合酶,碱基互补配对,(2)PCR的结果 DNA聚合酶只能特异地复制处于 的DNA序列，使这段固定长度的序列呈 扩增。,两个引物之间,指数,问题探究,1.PCR原理 PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。,答案 不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一
4、小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA。,答案,答案 PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高温。,2.PCR反应过程 (1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？,答案 每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。,(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。,答案,(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？,答案,答案 DNA的羟基(OH)末端为3端；磷酸基团的末端为5端。当引
5、物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,归纳总结,PCR扩增与DNA复制的异同,拓展应用,1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是 A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链 B.DNA复制不需要引物 C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合 D.PCR扩增的对象是氨基酸序列,解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物。DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，而不能从5端延伸DNA链。引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合。PCR扩增的对象是DNA，
6、不是氨基酸序列。,答案,解析,2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题： (1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是 。,答案,解析,DNA的热变性原理,解析 PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。,(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶。该酶是从 中分离的。,答案,解析,水生耐热细菌Taq,解析 Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。,(3)与普通DNA聚合酶相比，T
7、aq DNA聚合酶具有的特性是 。,耐高温,解析 与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。,(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。,解析 PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。,一定的缓冲溶液,温度,(5)PCR中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。,答案,解析,2,解析 PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，
8、成为DNA复制的起点。,作为DNA复制的起点,答案 需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。,一题多变 细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？,答案,与PCR原理有关的三个易错点 (1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。 (2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。 (3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解
9、旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。,二、PCR的实验操作,基础梳理,1.实验用具,温度,场所,更换,2.实验步骤 准备：按照PCR反应需要的物质和条件，将需要的试剂和仪器准备好 移液：用 按照配方在微量离心管中依次加入各试剂 混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻弹击 ，使反应液混合均匀 离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在_ 反应：将离心管放入 中进行反应,微量移液器,管的侧壁,离心,管底部,PCR仪,3.DNA含量的测定 (1)测定原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值
10、的大小与 有关。 (2)计算方法：DNA含量(g/mL) 稀释倍数。,DNA含量,50(260 nm的读数),问题探究,1.实验过程分析 (1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？,答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。,答案,(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？,答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。,(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？,答案 为避免外源DNA
11、等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。,答案,2.结果检测 (1)实验中为什么要测定DNA的含量？,答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。,答案 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。 电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。,(2)如何判断DNA扩增成功？,答案,答案 样品产物少，或产生新的DNA。,(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？,拓展应用,3.进行PCR反应的具体实验操作顺序应为 设计好PCR仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器向微量离
12、心管中依次加入各组分 进行PCR反应 离心使反应液集中在离心管底部 A. B. C. D.,解析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。,答案,解析,4.近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。,(1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在酶的作用下进行的。,氢
13、,解旋,解旋,答案,(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。当温度降低至55 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 。 (3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的 和 ，前者由 自动调控，后者则靠 来维持。 (4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是 。,两,3,从子链的5端向3
14、端延伸,温度,酸碱度,PCR仪,缓冲液,1/8,答案,解析,问题导析,问题导析 (1)解旋是使DNA双链间的氢键断裂，PCR技术是利用DNA的原理，细胞内是在 酶的作用下解旋。 (2)DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有 个。,答案,返回上页,热变性,解旋,2,解析 (1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。 (2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(95 )、复性(55 )、延伸(72 )，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA
15、聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。 (3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。 (4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。,返回上页,课堂小结,引,物,复性,放入PCR仪,稀释,调零,当堂检测,2,3,4,5,1,1.PCR利用了DNA的哪种特性来控制DNA的解聚与结合 A.特异性 B.稳定性 C.热变性 D.
16、多样性,答案,2.符合PCR反应条件的一项是 稳定的缓冲液环境 DNA模板 合成引物 四种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 DNA解旋酶 限制酶 温控设备 A. B. C. D.,2,3,4,1,5,答案,解析 PCR反应模拟了生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。,解析,3.下列关于PCR的描述中，正确的是 PCR是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增DNA利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列 A. B. C. D.,2,3,4,1,5,答案,解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后
17、，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3端连接脱氧核苷酸。,解析,4.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物,2,3,4,1,5,答案,解析,A.第一次循环 B.第二次循环 C.第三次循环 D.第四次循环,2,3,4,1,5,解析 在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。,
18、5.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题： (1)DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的开始延伸DNA链。,2,3,4,1,5,解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3端，含磷酸基团的是5端。引物的5端与模板链的3端结合，然后沿着引物的3端延伸。,磷酸基团,3端,答案,解析,(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到 ，它的发现和应
19、用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。,2,3,4,1,5,解析 耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。,耐高温的Taq DNA聚合酶,选择培养基,答案,解析,(3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有 个这样的DNA片段。,2,3,4,1,5,解析 PCR一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。,变性、复性和延伸,32,答案,解析,(4)简述PCR技术的主要应用：_(要求至少答两项)。,遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、,基因克隆和DNA序列测定等,
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