第2课时 分离以尿素为氮源的微生物 学案(含答案)
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1、第第 2 课时课时 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物 学习目标 1.进行微生物分离。使用含有尿素的培养基,采用涂布分离法,分离有脲酶的细 菌。 2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。 3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实 验原理。4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。 一、实验原理 1.脲和脲酶 (1)脲:又称尿素,是蛋白质降解的产物。人和其他哺乳动物的尿中都含有尿素,大量尿素的 存在会对环境造成污染。 (2)脲酶:降解尿素的酶。 (3)以尿素为氮源的微生物的特点:含有脲酶,通过降解尿素作为其生长的氮源。其利用尿素 的反应式为: (NH2)2C=
2、OH2O 脲酶 2NH3CO2。 2.实验目的 (1)使用专一的培养基(含有尿素)分离专一的细菌(有脲酶的细菌)。 (2)利用指示剂颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的反应。 3.实验原理 (1)不同微生物利用的氮源种类不同, 有一些细菌含有脲酶, 通过降解尿素作为其生长的氮源。 (2)尿素在脲酶的作用下降解产生 NH3,使培养基的 pH 升高,培养基中的酚红指示剂变成红 色。 4.两种培养基的比较 项目 全营养 LB 固体培养基 尿素固体培养基 培养基 组成 0.25 g 蛋白胨,0.12 g 酵母提取物, 0.25 g NaCl, 0.5 g 琼脂糖, 25 mL 水 0.025 g 葡萄糖,
3、0.12 g NaCl,0.12 g K2HPO4,0.25 mg 酚红,0.5 g 琼脂糖, 15 mL 水,10 mL 尿素溶液 灭菌 方法 高压蒸汽灭菌 10 mL 尿素溶液采用 G6 玻璃砂漏斗过 滤灭菌,其余用高压蒸汽灭菌,60 时 两者混合 上述属于选择培养基的是尿素固体培养基。用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基的原因是:琼 脂中含有少量含氮化合物,用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂,是为了尽可能使 培养基中只含尿素一种含氮化合物,以防止琼脂中的含氮化合物被不能以尿素为氮源的细菌 利用,有利于对以尿素为氮源的细菌的筛选。 特别提醒 能在选择培养基上生长的不一定是目的菌 原则上选择
4、培养基只能允许特定种类的微生物生长,但实际上,微生物的培养是一个非常复 杂的问题,有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖,因此能在选择培养基上生 长的微生物不一定都是所需的微生物,还需进一步鉴定。 例 1 (2018 温州高二检测)下列有关尿素培养基的叙述,错误的是( ) A.根据物理性质划分,该培养基属于固体培养基 B.培养基中的唯一氮源为尿素,用以筛选以尿素为氮源的微生物 C.培养基中的酚红,用于鉴别以尿素为氮源的微生物 D.培养基中加入 G6 玻璃砂漏斗过滤的尿素后,要用 500 g/cm2压力(90 以上)灭菌 30 min 答案 D 解析 因为尿素加热会分解,所以应先将培养基
5、经 500 g/cm2压力灭菌 30 min,再添加经过 G6 玻璃砂漏斗过滤后的尿素。 例 2 尿素是一种高浓度氮肥且长期施用没有不良影响,但尿素只有通过土壤中某些细菌的 分解作用,才能被植物吸收利用。 某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌,并尝试进行计数,培养基配方如下表: K2HPO4 NaCl H2O 葡萄糖 尿素 酚红 琼脂 0.12 g 0.12 g 15 mL 0.025 g 2.0 g 0.25 mg 0.5 g (1)分解尿素的细菌都能合成_,该种细菌在生态平衡中起到什么作用? _。 写出细菌分解尿素的反应式: _。 (2)根据培养基的成分判断, 该同学能否分离出土壤中分解尿
6、素的细菌?_(填“能”或 “不能”),原因是_ _ _。 (3)尿素在高温下容易分解,因此常用_对尿素进行过滤灭菌,而该器材在进 行过滤灭菌操作前应使用_法进行灭菌。 答案 (1)脲酶 参与了氮循环(或维持氮平衡) (NH2)2C=OH2O 脲酶 2NH3CO2 (2)不能 琼脂是未被纯化的混合物,内含一定的含氮化合物,尿素不是唯一氮源,不能选择 出只以尿素为氮源的细菌 (3)G6 玻璃砂漏斗 高压蒸汽灭菌 解析 (1)含有脲酶的细菌通过降解尿素作为其生长的氮源,从而也起到维持生物圈氮元素平 衡的作用,脲酶分解尿素的反应式为:(NH2)2C=OH2O 脲酶 2NH3CO2。(2)从培养基的 成
7、分看,因为含有琼脂,所以不能分离出分解尿素的细菌,因为琼脂是一种未被纯化的混合 物, 内含一定量的含氮化合物, 不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。 (3)尿素在高温下易分解, 应采用 G6 玻璃砂漏斗过滤灭菌,G6 玻璃砂漏斗在使用之前,需采用高压蒸汽灭菌法进行灭 菌。 方法技巧 筛选菌株的原理 (1)原理: 根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、 物理因素的抗性不同而制备培养基。 (2)方法 在培养基中加入某种化学物质。例如,加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌;加入高浓度 的食盐可以筛选出金黄色葡萄球菌。 改变培养基中的营养成分。例如,缺乏氮源时可以分离固氮微生物;石油作为唯一碳源时, 可以
8、分离出能降解石油的微生物;用含无机碳源的培养基分离出自养型微生物。 改变微生物的培养条件。例如,将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物; 用普通培养基在无氧条件下分离出厌氧型和兼性厌氧型微生物。 二、实验操作与分析 1.实验中的对照设置 (1)实验组:以尿素固体培养基进行培养。 (2)对照组:以全营养 LB 固体培养基进行培养。 2.实验步骤 3.实验结果 培养基 细菌悬液稀释度 10 4 10 5 LB 固体培养基 尿素固体培养基 (1)稀释度为 10 4 的培养基中的平均菌落数多。 (2)在相同稀释度的情况下,尿素培养基中的平均菌落数少于 LB 培养基中的平均菌落数,其 原因是大
9、多数微生物不能利用尿素为氮源。 (3)在尿素培养基上的菌落周围会出现红色的环带。 归纳总结 1.样品稀释的问题 (1)稀释原因:样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。当样品的稀释度足够高时, 培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。因此,恰当的稀释度是成功 地统计菌落数目的关键。 (2)稀释标准:选用一定稀释范围的样品液进行培养,保证获得菌落数在 30300 之间,便于 计数。 2.与涂布平板有关的问题 (1)防止培养基外溅:在倒平板的过程中,不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,因为空 气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 (2)涂布器的灭菌:玻璃刮刀用 7
10、0%酒精消毒,取出时,多余酒精在烧杯中滴尽,沾有少量酒 精的玻璃刮刀在酒精灯火焰上引燃。 (3)设置对照:可排除实验中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。 3.酚红指示剂的选择 本实验中,酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中,其变色的 pH 范围是 6.48.2,在酸性 条件下呈黄色,碱性条件下呈红色。 以尿素为氮源的微生物培养一段时间后,由于细菌产生的脲酶向周围扩散,将培养基中的尿 素分解,产生的 NH3使培养基的 pH 升高变成碱性,于是培养基中的酚红指示剂变成红色, 圆形红色区域愈大,表明这种菌利用尿素的能力愈强。 例 3 (2018 浙江名校“新高考”联盟)请分析回答以下
11、关于分离以尿素为氮源的微生物实 验的问题: (1)脲酶可以催化尿素分解为_,其中碱性物质可以使酚红指示剂变为_。 (2)分离以尿素为氮源的微生物, 培养基配制必须加凝固剂_, 培养基在_ g/cm2 压力下灭菌 30 分钟,冷却至 60 ,加入通过_的尿素溶液,混合均匀待用。 (3)为了从土壤中分离得到以尿素为氮源的微生物,分离效果比较好的操作方法是采用 _,采用该方法分离,土壤溶液必须经过_处理。 答案 (1)NH3和 CO2 红色 (2)琼脂糖 500 G6 玻璃砂漏斗过滤 (3)涂布分离法 稀 释 例 4 (2019 嘉兴模拟)幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素
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