第1课时 大肠杆菌的培养和分离 学案(含答案)
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1、第第 1 课时课时 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离 学习目标 1.进行大肠杆菌的扩增,利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌 的分离,用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。 一、微生物培养的基本条件 1.微生物 (1)概念:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。 (2)用途:许多种抗生素来源于放线菌和霉菌;酒由酵母发酵产生;腐乳由红曲霉和毛霉发酵 制成;微生物能用于治理环境污染,在新能源领域也将发挥巨大作用。 2.培养基 (1)概念:培养基是微生物生存的环境和营养物质。 (2)分类:培养基按物理性质常可分为固体培养
2、基和液体培养基,一般都含有水、碳源、氮源 和无机盐四类营养物质,另外还需满足微生物生长对 pH、特殊营养物质和氧气的要求。通常 细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制, 还要加入一定量的氯化钠以维持一定的渗透压; 霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。 (3)酸碱性:细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长,霉菌要求在中性偏酸的环境中生长;因 此,在制备培养基时需调节培养基的酸碱度。 特别提醒 有关培养微生物所需营养的三点提醒 (1)不同微生物对营养的需求不同,所以培养不同的微生物所需要的营养可能不同。 (2)对异养微生物来说,含 C、H、O、N 的有机物既是碳源又是氮源、能源。 (3)
3、培养微生物时营养物质要协调。营养物质过少不能满足微生物的营养需要,过多对微生物 的生长有抑制作用。 3.灭菌操作 (1)常见灭菌方法 对于培养皿、试管、三角瓶、镊子等常采用高压蒸汽灭菌法灭菌。 对于不能加热灭菌的化合物,如尿素等,只能用 G6 玻璃砂漏斗过滤,但玻璃砂漏斗使用 前也要在 121 下用纸包好灭菌。 实验操作过程中,一般采用灼烧的方法对接种环进行灭菌。 (2)高压蒸汽灭菌操作的要求 灭菌前各种用品均需用牛皮纸或报纸包好,在 121 下灭菌 15 min,实验过程中所需的棉 花不能用脱脂棉,因为其易吸水,吸水后容易引起污染。 如培养基中有葡萄糖,为防止其分解碳化,要用 500_g/c
4、m2压力(90 以上)灭菌 30 min。 归纳总结 1.培养基的类型 划分 标准 培养基种类 特点 用途 按物理 状态 液体培养基 不加凝固剂 扩大培养或工业生产 半固体培养 基 加少量凝固剂而呈半固体状态 观察微生物的运动、 分类 鉴定 固体培养基 加入凝固剂,如琼脂、明胶、硅胶等 微生物分离、鉴定、活菌 计数、保藏菌种 按功能 选择培养基 允许特定种类的微生物生长,同时抑 制或阻止其他微生物生长 培养分离特定的微生物 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点,在培养基中 加入某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物 按化学 成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 合成培养基 培
5、养基的成分已明确 分类、鉴别 2.无菌操作,既包括各种器皿必须是无菌的,也包括各种培养基必须是无菌的,同时还要求 在接种时,不能带有其他杂菌,所以在实验过程中,应时刻保持这种无菌意识。 例 1 (2018 浙江学军中学月考)下列关于培养基的说法,不正确的是( ) A.培养基配制的原则一是目的要明确,二是营养要协调、三是 pH 要适宜 B.配制培养基时还要考虑微生物对特殊营养物质的要求,否则微生物可能不能生长或生长极 差 C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基 D.选择培养基是允许特定种类微生物生长,但抑制或阻止其他微生物生长的培养基 答案 C 解析 培养基配制的原则一是目的要明确,弄清培
6、养基的所属类型,二是营养要协调,符合 目的微生物的生长需求,三是 pH 要适宜,A 正确;有的微生物对营养物质具有特殊的要求, 配制培养基时还要考虑微生物对特殊营养物质的要求, 否则微生物可能不能生长或生长极差, B 正确;固体培养基中去除凝固剂(如琼脂、明胶等)即可制成液体培养基,C 错误;选择培养 基是指在微生物学中,允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的 培养基,目的是从众多微生物中分离所需要的微生物,D 正确。 例 2 (2019 温州高二检测)下列关于灭菌的叙述,正确的是( ) A.用于细菌等微生物培养的培养基都必须用高压蒸汽灭菌锅灭菌 B.锥形瓶、培养皿、移液
7、管等器具的高压蒸汽灭菌时间一般为 15 min(121 条件下) C.超净工作台或接种箱用紫外灯灭菌 30 min 即可 D.灭菌后的培养基、器具就已经达到了完全无菌 答案 B 解析 培养基通常可以进行高压蒸汽灭菌,若培养基中有碳酸氢钠、尿素等高温易分解的成 分,就不能用此方法,A 项错误;超净工作台或接种箱用紫外灯灭菌 30 min,同时还需打开 过滤风,C 项错误;灭菌后的培养基、器具不一定达到了完全无菌,而且要防止二次污染, D 项错误。 方法技巧 三种常用灭菌方法的比较 灭菌方法 适用材料或用具 灭菌条件 灭菌时间 灭菌后处理 高压蒸汽 灭菌 培养基、玻璃器皿等 121 , 1 kg/
8、cm2 压力(若培养基 中含有葡萄糖, 为防止其碳化, 90 以上,500 g/cm2压力) 15 min(若含有 葡萄糖,灭菌时 间 30 min) 实验用具在60 80 烘箱中烘 干;培养基冷却 待用 灼烧灭菌 接种环、 接种针或其他 金属用具;玻璃刮刀 在酒精灯火焰的 充分燃烧层灼烧 烧红(或玻璃刮 刀上的酒精燃 尽) 防止过热杀死目 的菌种,冷却后 使用 过滤灭菌 不能加热灭菌的化合 物,如尿素培养基等 G6 玻璃砂漏斗 过滤 尿素滤液过滤 完毕 玻璃砂漏斗用 1 mol/L 的 HCl 浸 泡,抽滤去酸后 蒸馏水洗至中 性,干燥后保存 二、细菌的培养与分离 1.细菌的分离方法 (1)
9、划线分离法:通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作。由于划线过程中,接种环上 的菌液逐渐减少,因此划线最后部分的细菌间距离加大,经过培养可获得单菌落。 (2)涂布分离方法:用此法分离时,需要先将培养的菌液稀释,通常稀释 10 5107 倍。取 0.1 mL 稀释度不同的菌液,加在培养皿的固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上, 然后进行培养。通常以每个培养皿中有 20 个以内的单菌落最为合适。 (3)两种分离法的比较:划线分离法,方法简单;涂布分离法,单菌落更易分开,但操作复杂 些。 2.大肠杆菌的培养和分离 (1)实验内容:将大肠杆菌扩大培养和划线分离,即用 LB 液体培养基扩大培养大
10、肠杆菌,培 养后再在 LB 固体平面培养基上划线进行分离,随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。 (2)实验步骤 培养基灭菌 倒平板 接种 划线分离 培养观察 菌种保存 将 50 mL LB 液体培养基和 50 mL LB 固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌 将培养基分别倒入 4 个灭菌后的培养皿中,水平放置,使之形成平面 在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌,培养 12 h 用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次,在固体培养基的平 板上连续划线,盖好培养皿 将培养皿倒置(盖在下面),放在 37 恒温培养箱中培养 1224 h 后,可 看到在划线的末端出现不连续的单个菌落 在无菌操作下将单
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